發(fā)布日期：2017-05-10

5月2日，《細(xì)胞生物學(xué)雜志》（Journal of Cell Biology）在線發(fā)表了題為《視網(wǎng)膜成體干細(xì)胞胚胎起源雙潛能細(xì)胞》的研究論文，該研究由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院神經(jīng)科學(xué)研究所、腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心何杰研究組完成。該研究采用基于彩虹魚克隆分析，在單細(xì)胞水平上揭示了視網(wǎng)膜干細(xì)胞在視網(wǎng)膜睫狀邊緣區(qū)的準(zhǔn)確定位；同時(shí)在邊緣區(qū)中發(fā)現(xiàn)一類目前尚未報(bào)道的靜息態(tài)細(xì)胞。此外，此研究采用原位細(xì)胞譜系追蹤，闡述了視網(wǎng)膜干細(xì)胞胚胎發(fā)育的精確細(xì)胞譜系，從而揭示視網(wǎng)膜干細(xì)胞起源于視泡 (optic vesicle)中間層上皮細(xì)胞中的一群雙潛能細(xì)胞。此項(xiàng)工作發(fā)現(xiàn)了視網(wǎng)膜干細(xì)胞發(fā)育的細(xì)胞譜系基礎(chǔ)，為進(jìn)一步揭示視網(wǎng)膜干細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制，最終實(shí)現(xiàn)視網(wǎng)膜干細(xì)胞微環(huán)境的體外重建提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在低等脊椎動(dòng)物中，視網(wǎng)膜干細(xì)胞位于視網(wǎng)膜睫狀邊緣區(qū)中。在低等脊椎動(dòng)物一生中，例如斑馬魚，視網(wǎng)膜能夠不斷增大。整個(gè)終生的視網(wǎng)膜生長(zhǎng)就是通過視網(wǎng)膜干細(xì)胞的增殖和分化而實(shí)現(xiàn)的。在進(jìn)化的過程中，更高等的脊椎動(dòng)物，視網(wǎng)膜睫狀邊緣區(qū)細(xì)胞產(chǎn)生各種視網(wǎng)膜神經(jīng)元的能力會(huì)更弱。但是越來(lái)越多的證據(jù)表明，在哺乳動(dòng)物中，視網(wǎng)膜睫狀邊緣區(qū)細(xì)胞仍然具備產(chǎn)生新的神經(jīng)元的潛能，只是在體內(nèi)環(huán)境中，這些潛能被沉默了。其原因目前尚不清晰，這也是神經(jīng)發(fā)育和再生領(lǐng)域一個(gè)重大命題。因此，更好地了解低等動(dòng)物視網(wǎng)膜干細(xì)胞的微環(huán)境及其胚胎起源，將更有助于了解高等脊椎動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜干細(xì)胞沉默的原因，為尋找激活這些干細(xì)胞的方法提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在以往以斑馬魚為模式動(dòng)物研究視網(wǎng)膜發(fā)育的過程中，發(fā)現(xiàn)眼柄通過外翻發(fā)育成具有中間上皮細(xì)胞和外側(cè)上皮細(xì)胞的視泡結(jié)構(gòu)，視泡中的中間上皮細(xì)胞通過遷移進(jìn)入外側(cè)上皮細(xì)胞，逐漸發(fā)育為視杯結(jié)構(gòu)，而視網(wǎng)膜的干細(xì)胞就是來(lái)源于這群視泡中間上皮細(xì)胞。但是對(duì)于視網(wǎng)膜干細(xì)胞在視網(wǎng)膜中的具體定位以及胚胎視網(wǎng)膜前體細(xì)胞發(fā)育為視網(wǎng)膜干細(xì)胞的精確細(xì)胞譜系模式尚不清楚。

研究團(tuán)隊(duì)以斑馬魚為模式動(dòng)物，采用基于彩虹魚的克隆分析，將視網(wǎng)膜干細(xì)胞精確定位于視網(wǎng)膜睫狀邊緣區(qū)最外周第二層或第三層細(xì)胞。相對(duì)于視網(wǎng)膜睫狀邊緣區(qū)中其他視網(wǎng)膜前體細(xì)胞，視網(wǎng)膜干細(xì)胞的細(xì)胞周期比較長(zhǎng)。此外，研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜睫狀邊緣區(qū)最外周第一層細(xì)胞是一類完全處于靜息狀態(tài)的新細(xì)胞類型。RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)表明，它們既不表達(dá)視網(wǎng)膜干細(xì)胞的分子標(biāo)記，也不表達(dá)或者僅微弱表達(dá)視網(wǎng)膜色素細(xì)胞相關(guān)的分子標(biāo)記。關(guān)于這類新的細(xì)胞對(duì)于視網(wǎng)膜干細(xì)胞的維持作用還需要進(jìn)一步研究。

在準(zhǔn)確定位視網(wǎng)膜干細(xì)胞的基礎(chǔ)上，研究人員進(jìn)一步尋找視網(wǎng)膜干細(xì)胞的胚胎起源。Kaede是一種光轉(zhuǎn)化蛋白，在405nm激光照射下，能夠由綠色變?yōu)榧t色。將核定位光轉(zhuǎn)化蛋白nls-kaede的mRNA注射到野生型斑馬魚的胚胎中。在視網(wǎng)膜發(fā)育的視泡階段，對(duì)表達(dá)Kaede蛋白的視泡中間上皮細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞光轉(zhuǎn)化，通過分析由單個(gè)上皮細(xì)胞衍生的克隆，研究人員發(fā)現(xiàn)：視網(wǎng)膜干細(xì)胞只能由視泡中間上皮細(xì)胞中一群雙潛能細(xì)胞產(chǎn)生；這群雙潛能細(xì)胞產(chǎn)生視網(wǎng)膜干細(xì)胞的同時(shí)產(chǎn)生視網(wǎng)膜色素細(xì)胞，是一群細(xì)胞周期比較短的細(xì)胞。RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)表明，這群雙潛能細(xì)胞既表達(dá)視網(wǎng)膜干細(xì)胞的分子標(biāo)記，也表達(dá)視網(wǎng)膜色素細(xì)胞的標(biāo)記。而視網(wǎng)膜視泡中間上皮細(xì)胞中的其他細(xì)胞則只能產(chǎn)生視網(wǎng)膜色素細(xì)胞或者視網(wǎng)膜前體細(xì)胞。

此工作在單細(xì)胞水平上揭示了視網(wǎng)膜睫狀邊緣區(qū)微環(huán)境中的細(xì)胞類型組成及其特征，為深入探究視網(wǎng)膜干細(xì)胞微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)維持提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。此外，雙潛能細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為深入研究視網(wǎng)膜干細(xì)胞胚胎發(fā)育的分子機(jī)制提供了細(xì)胞譜系基礎(chǔ)，為最終理解視網(wǎng)膜干細(xì)胞的產(chǎn)生和維持機(jī)制提供可能。

此項(xiàng)工作由助理研究員湯霞和實(shí)習(xí)生高嘉男在研究員何杰的指導(dǎo)下完成；課題組的賈新玲協(xié)助完成了重要的RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)；研究期間項(xiàng)目還得到了上海生科院健康科學(xué)研究所潘巍峻研究團(tuán)隊(duì)的協(xié)助。該工作獲得國(guó)家自然科學(xué)基金（31471042）和青年千人計(jì)劃的資助。

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圖：在斑馬魚出生后18小時(shí)到26小時(shí)這段期間，視泡中間上皮細(xì)胞層的快速分裂的雙潛能細(xì)胞（BP，藍(lán)色）遷移進(jìn)入外側(cè)上皮細(xì)胞層，在這個(gè)過程中雙潛能細(xì)胞增殖產(chǎn)生一個(gè)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的前體細(xì)胞（PP，黑色）和一個(gè)視網(wǎng)膜干細(xì)胞的前體細(xì)胞（SP，紅色）。隨后視網(wǎng)膜干細(xì)胞的前體細(xì)胞（SP，紅色）表現(xiàn)出較長(zhǎng)的細(xì)胞周期，并通過細(xì)胞分裂產(chǎn)生三種類型的細(xì)胞譜系模式：一種為非対稱分裂產(chǎn)生一個(gè)視網(wǎng)膜干細(xì)胞（S，紅色）和一個(gè)CMZ尖端靜息態(tài)細(xì)胞（D；黑色/紅色；占RSC產(chǎn)生的細(xì)胞譜系的60%）；第二種為非對(duì)稱分裂產(chǎn)生一個(gè)視網(wǎng)膜干細(xì)胞RSC（S，紅色）和一個(gè)視網(wǎng)膜前體細(xì)胞（RP，紅色；占RSC產(chǎn)生的細(xì)胞譜系的38%）；第三種為對(duì)稱分裂產(chǎn)生兩個(gè)視網(wǎng)膜干細(xì)胞（S，紅色；占RSC產(chǎn)生的細(xì)胞譜系的2%）。與此同時(shí)，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞前體細(xì)胞（PP，黑色）通過增殖分裂產(chǎn)生兩種類型的細(xì)胞譜系：一種細(xì)胞譜系包括兩個(gè)視網(wǎng)膜色素細(xì)胞（P；黑色，64%）；另外一種細(xì)胞譜系包括一個(gè)視網(wǎng)膜色素細(xì)胞（P，黑色）和一個(gè)CMZ尖端靜息態(tài)細(xì)胞（D，黑色/紅色；36 %）。CMZ尖端靜息態(tài)細(xì)胞（D，黑色/紅色）既可以由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞前體細(xì)胞（PP, 黑色）產(chǎn)生，也可以由視網(wǎng)膜干細(xì)胞前體細(xì)胞（SP，紅色）產(chǎn)生。

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