發(fā)布日期：2018-03-30

繼“大師兄”被克隆以來，能精準(zhǔn)模擬人類疾病的“二師兄”也成功地被克隆出來

　　導(dǎo)語：

　　在廣州九龍鎮(zhèn)有一座“豬賓館”，生活著一群身嬌肉貴的實(shí)驗(yàn)小豬，它們能精準(zhǔn)地模擬人類的疾病。這是因?yàn)榭茖W(xué)家利用基因“剪刀”—— CRISPR/Cas9，精準(zhǔn)地把人突變的亨廷頓基因HTT敲入到豬的亨廷頓基因中，從而使豬得了亨廷頓舞蹈病。這些經(jīng)過改造的豬可應(yīng)用于人類試藥、干細(xì)胞的臨床前評價(jià)等領(lǐng)域，最終將造福人類健康。這項(xiàng)研究也是繼今年1月以來，中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所一組學(xué)者在克隆猴領(lǐng)域取得的重大突破以來，該領(lǐng)域又一重要的發(fā)現(xiàn)。

　　經(jīng)過四年努力，由暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院李曉江教授、中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)研究員以及美國Emory大學(xué)李世華教授領(lǐng)銜的國際研究團(tuán)隊(duì)，首次利用基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9和體細(xì)胞核移植技術(shù)（SCNT），成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬，精準(zhǔn)地模擬出人類神經(jīng)退行性疾病。

這項(xiàng)研究的三位通訊作者，李世華（前排左）李曉江（前排中）和賴良學(xué)（前排右）。

亨廷頓舞蹈癥豬模型的構(gòu)建，研究的共同第一作者分別為閆森副研究員、涂著池博士和劉朝明。

HD 基因敲入豬制備流程圖

　　這項(xiàng)研究為開發(fā)治療亨廷頓舞蹈癥，提供了穩(wěn)定、可靠的動(dòng)物模型，也為培育其它神經(jīng)退行性疾病大動(dòng)物模型提供了技術(shù)和理論依據(jù)，將推動(dòng)我國發(fā)展出大動(dòng)物疾病模型的醫(yī)藥研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈，相關(guān)研究于北京時(shí)間3月30日在線發(fā)表在國際頂尖學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞》雜志上。

　　李曉江對《知識分子》表示，“我們把這個(gè)動(dòng)物模型建起來之后，也可以建立其他的疾病動(dòng)物模型，如阿爾茲海默癥、帕金森病等疾病的豬模型，它們要比小鼠的疾病模型會(huì)更好。因此從動(dòng)物模型的構(gòu)建來說，這有重要的意義；第二點(diǎn)，我們可以用這個(gè)模型來篩選藥物治療的方法，如小鼠動(dòng)物模型由于缺乏神經(jīng)元死亡重要的病理特征，用藥評價(jià)一般都是基于行為學(xué)觀察，而豬是非常好的模式動(dòng)物來評價(jià)藥物的效果。”

　　李曉江是美國Emory大學(xué)人類遺傳系教授，在神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域做出許多重要成果，2010年入選為中組部“千人計(jì)劃”，2017年成為暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院教授。該研究院以暨南大學(xué)-香港大學(xué)腦功能與健康聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室為基礎(chǔ)，2012年正式成立。

　　亨廷頓舞蹈癥是單基因突變導(dǎo)致的疾病

　　亨廷頓舞蹈癥、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥等，是當(dāng)今社會(huì)嚴(yán)重威脅人類健康的神經(jīng)退行性疾病。這些疾病伴隨年齡漸長而產(chǎn)生、可遺傳、呈漸進(jìn)性發(fā)展，由于缺乏合適的動(dòng)物模型進(jìn)行藥物篩選，目前尚無有效的治療方法。

　　李曉江說，神經(jīng)退行性疾病是致病蛋白變異后沉淀在神經(jīng)細(xì)胞中，造成神經(jīng)細(xì)胞功能紊亂，并引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生。而亨廷頓舞蹈病是由單基因（HTT）突變導(dǎo)致的神經(jīng)退性疾病，是一個(gè)理想的疾病模式，可用于研究蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊如何引起選擇性的神經(jīng)退性病變，為以后多基因突變病癥研究提供基礎(chǔ)。

　　“夫妻檔”科學(xué)家與猴做朋友

　　小鼠作為最常見的動(dòng)物模型，已被廣泛地用于研究人類疾病機(jī)理和尋找臨床治療方法。李曉江團(tuán)隊(duì)在研究中發(fā)現(xiàn)，表達(dá)突變基因的神經(jīng)退行性疾病小鼠模型，并不能表現(xiàn)出像病人腦中一樣的典型神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要病理特征。許多有治療效果的藥物在小鼠模型中有效，在臨床上對病人往往無效。為了探索動(dòng)物模型，他開始把目光轉(zhuǎn)移到大動(dòng)物、非人靈長類動(dòng)物身上。

　　早在2008年，“夫妻檔”科學(xué)家李曉江、李世華在美國Emory大學(xué)合作者的支持下，通過將外源性的突變基因引入到獼猴的體內(nèi)，成功地建立了世界首只轉(zhuǎn)基因亨廷頓病猴模型。李曉江說，在該模型中，可以明顯地觀察到相應(yīng)的病理特征和行為變化，但表達(dá)外源性致病基因片段的毒性過強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)基因猴子基本上在出生后較短時(shí)間內(nèi)死亡，同時(shí)無法傳代。因此轉(zhuǎn)基因亨廷頓疾模型無法達(dá)到篩選治療疾病的藥物的目的。

　　為何“二師兄”成為科學(xué)家的掌中寶？

亨廷頓舞蹈癥模型豬得到科研人員的嚴(yán)密呵護(hù)

　　位于廣州九龍鎮(zhèn)的“豬賓館”，科學(xué)家正精心飼養(yǎng)著一群身價(jià)不菲的實(shí)驗(yàn)小豬。與果蠅、線蟲、小鼠等小動(dòng)物相比，豬被公認(rèn)為是人類醫(yī)學(xué)研究理想的大動(dòng)物模型。

　　賴良學(xué)解釋道，豬的心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚、營養(yǎng)需要、骨骼發(fā)育以及礦物質(zhì)代謝等都與人的情況極其相似，豬的體型大小和馴服習(xí)性允許科研人員進(jìn)行反復(fù)采樣和各種外科手術(shù)。

　　他還提到，與非人靈長類動(dòng)物相比，豬的基因多樣、繁殖周期短、一窩產(chǎn)仔多，便于根據(jù)特殊需要進(jìn)行選育，也不存在倫理學(xué)方面的問題。所以豬的疾病模型用于做藥物篩選、人類疾病研究、干細(xì)胞治療的研究結(jié)果，更容易轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。作為華南地區(qū)重要的大動(dòng)物疾病模型實(shí)驗(yàn)平臺之一，賴良學(xué)團(tuán)隊(duì)先后建立了50余種在生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有重要價(jià)值的轉(zhuǎn)基因和基因打靶克隆豬。

　　2010年，這對“夫妻檔”找到了賴良學(xué)，他們一拍即合，合作建立了首例轉(zhuǎn)基因亨廷頓病豬模型。與猴模型一樣，豬模型也具有明顯的表型特征，但不易存活、無法傳代。這一問題讓他們感到非常困惑，“人是在某個(gè)定點(diǎn)的基因突變而導(dǎo)致亨廷頓疾病，而目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)是隨機(jī)地在體內(nèi)基因組中插入外源性突變基因，其表達(dá)量也高于內(nèi)源性致病因。”

　　大膽的設(shè)想：“基因魔剪”和克隆技術(shù)幫大忙

　　研究人員進(jìn)而分析發(fā)現(xiàn)，亨廷頓舞蹈病是內(nèi)源性基因突變而造成的，如果直接把豬的內(nèi)源性基因改變?yōu)橥蛔兓颍i的病理變化應(yīng)該與病人的病理狀態(tài)更接近。然而，基因敲入的效率太低，在大動(dòng)物中很難獲得。2013年，隨著基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9被廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物中，在廣東省科技計(jì)劃的支持下，他們大膽嘗試這一科學(xué)設(shè)想，李世華著手應(yīng)用Cas9技術(shù)建立亨廷頓基因敲入豬模型。

　　通過團(tuán)隊(duì)通力的合作，他們利用CRISPR/Cas9技術(shù)，將人突變的亨廷頓基因插入到豬的內(nèi)源性亨廷頓基因的表達(dá)框中，即人外顯子1中包含150 CAG重復(fù)序列，精確地插入到豬的HTT內(nèi)源性基因中。

　　但最終能否成功，還要看實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展。研究者利用成纖維細(xì)胞篩選出陽性克隆細(xì)胞，事實(shí)上，這也并非易事。“單細(xì)胞逐個(gè)挑出來并進(jìn)行篩選及鑒定，一定要挑選狀態(tài)最好的細(xì)胞用來胚胎移植”。負(fù)責(zé)此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)工作的閆森先后篩選了上千個(gè)細(xì)胞，從中挑出確定帶有突變基因且狀態(tài)最好的細(xì)胞，她說，“每天早上7點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞間，看細(xì)胞、換液、不停地跟細(xì)胞打交道，一抬頭已是下午3點(diǎn)。好不容易篩選到的陽性克隆細(xì)胞如果狀態(tài)不好又得重來，只有大量篩選才能獲得最優(yōu)的細(xì)胞克隆。”

　　“這的確是一個(gè)很大的工作量。”李曉江表示。除此之外，還遇到其他的困難，“當(dāng)我們的F0代豬出生時(shí)，盡管數(shù)量比較多，但一開始沒經(jīng)驗(yàn)，由于群養(yǎng)爭斗、搶食等因素，造成亨廷頓舞蹈癥的模型豬死了不少，幸好還有兩只存活下來，然后我們讓它們交配，產(chǎn)生F1代的豬，之后再產(chǎn)生F2的豬。第三個(gè)難點(diǎn)是，模型豬傳代也比較困難，只有穩(wěn)定遺傳特定表型的豬，才是我們想要的。”

正常的和患有亨廷頓癥的豬模型行為比較

　　幸運(yùn)的是，這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)順利地進(jìn)入到下一步，他們運(yùn)用體細(xì)胞核移植技術(shù)進(jìn)行克隆，成功培育出帶有突變基因的新生豬。在歷經(jīng)5個(gè)月的觀察后，亨廷頓豬出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)障礙等漸進(jìn)性發(fā)病的表型。再進(jìn)一步就是將穩(wěn)定表達(dá)的基因敲入亨廷頓豬繁殖下去。由于疾病模型豬身體狀態(tài)不好，在傳代過程中更需要悉心的照料。在團(tuán)隊(duì)的呵護(hù)下，最終這些亨廷頓舞蹈癥模型豬生產(chǎn)出小豬。

　　為了證明亨廷頓基因敲入豬的病理特征更接近于人類。李世華多次從美國返回國內(nèi)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，到豬場看小豬的生存環(huán)境及生活狀態(tài)。至于模型豬能否很好地評估人類的亨廷頓舞蹈癥，它與人的疾病癥狀有多相近？

　　李曉江就此對《知識分子》表示，“總體來說，還只能說是相近，兩個(gè)物種畢竟還是有種屬差別。但在很多方面，如豬的神經(jīng)細(xì)胞死亡病理方面跟人非常相近，而小鼠沒有明顯的神經(jīng)細(xì)胞死亡特征。另外，小鼠的‘舞蹈’行為很難體現(xiàn)出來，豬的這些行為跟人非常相似。此外，我們也發(fā)現(xiàn)，這些模型豬很多是因?yàn)楹粑ソ叨劳?，跟亨廷頓舞蹈癥病人一樣，它們也因運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的死亡，容易引起肺炎，進(jìn)而死亡，所以從豬的這些病理表型和行為，跟人更為接近。

　　小心求證：亨廷頓舞蹈癥豬模型構(gòu)建成功

亨廷頓基因敲入豬紋狀體中明顯的神經(jīng)元死亡

紋狀體出現(xiàn)明顯的萎縮

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果傳來，他們成功了。該模型不但能夠模擬亨廷頓癥患者大腦紋狀體的神經(jīng)元選擇性死亡的典型病理特征，在行為上也表現(xiàn)出類似亨廷頓癥”舞蹈樣“的異常行為。

　　更難能可貴的是，這些病理及行為學(xué)表型都可穩(wěn)定地遺傳給后代。作為世界首例亨廷頓病豬基因敲入模型，它表明在模擬病人的神經(jīng)病理變化特別是腦疾病方面，大動(dòng)物模型比小動(dòng)物模型更具優(yōu)勢。

　　可為人類試藥，造福于人類

　　神經(jīng)疾病基因敲入豬的成功，將推動(dòng)我國發(fā)展出大動(dòng)物疾病模型的醫(yī)藥研發(fā)產(chǎn)業(yè)鏈，促進(jìn)針對阿爾茨海默病、帕金森癥等神經(jīng)退行性疾病，以及免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新藥研發(fā)進(jìn)程。同時(shí)，該動(dòng)物模型可用于干細(xì)胞治療等手段的臨床前評價(jià)，最終造福于人類。

　　從事多年研究亨廷頓病的資深專家、美國加州大學(xué)洛杉磯分校楊向東（X. William Yang）教授指出，亨廷頓舞蹈癥基因敲入豬的建立是神經(jīng)退行性疾病研究領(lǐng)域中一個(gè)里程碑式的發(fā)現(xiàn)，使科學(xué)家能更深入了解神經(jīng)細(xì)胞死亡的機(jī)制及尋找有效的治療方法。

　　非人靈長類動(dòng)物模型是否會(huì)比豬模型會(huì)更好呢？今年1月25日，中科院神經(jīng)科學(xué)研究所孫強(qiáng)等研究人員率先利用體細(xì)胞克隆出猴，備受外界關(guān)注，其中有一點(diǎn)是，未來這些克隆猴也會(huì)用來構(gòu)建疾病模型。未來需不需要構(gòu)建亨廷頓舞蹈癥猴模型？李曉江表示，”目前亨廷頓舞蹈癥猴模型還沒有，主要是由于基因敲入猴胚胎的效率太低。“但他同時(shí)表示，構(gòu)建這一疾病的猴模型仍十分有意義，因?yàn)樗谛袨樘卣鞅憩F(xiàn)上會(huì)比豬模型會(huì)更好，由此能更好地尋找有效的治療策略。

來源：知識分子（微信號 The-Intellectual）